Одной из наиболее бурно развивающихся проблем современной биохимии является проблема биологического катализа и в частности — изучение химического и физического строения ферментов и механизма их действия.
Изучение ферментов — их строения, механизма действия и т. д. — предполагает наличие высокоочищенных ферментных препаратов. Всякая энзимоло-гическая работа должна начинаться с выделения и очистки изучаемого фермента, освоения методов оп-. ределения активности, подбора условий для определения истинной скорости реакции. Именно этим вопросам уделяется главное внимание в предлагаемом руководстве.
Основным критерием при подборе методик выделения и очистки ферментов и определения активности являлась достаточная их воспроизводимость в условиях практикума. Учитывалась также доступность реактивов, источников исходного материала и оборудования, которые требуются для проведения работы, а также имелось в виду включить основные современные методы очистки ферментов.
В специальный раздел выделено использование ферментов в качестве аналитических реагентов. Их применение для количественного определения ряда веществ, а также в качестве сопрягающих агентов—при измерении активности других ферментов, является весьма перспективным. Эти методы не только более быстрые, точные и специфические, чем большинство применявшихся до сих пор, но в ряде случаев — единственно возможные. К сожалению,
внимание, уделяемое им в настоящее время, далеко от того, которое они заслуживают.
Чтобы студент не механически выполнял ту или .иную задачу, а имел определенное представление о том объекте или о том методе, с которым он работает, определенное место в руководстве уделено теоретическим предпосылкам.
Настоящее практическое руководство предназначается для студентов, проходящих практикум по энзимологии. Кроме того, оно может быть использовано при прохождении отдельных разделов большого практикума по биохимии, а также в экспериментальной работе студентами-дипломниками, аспирантами и научными сотрудниками, работающими в области энзимологии.
За просмотр рукописи и ценные замечания автор выражает 'признательность сотрудникам кафедры биохимии животных биолого-почвенного факультета МГУ, а также проф. И. П. Ашмарину и В. А. Яковлеву и доц. С. Н. Лызловой.
Все критические замечания будут приняты автором с благодарностью.
Г. Кочетов
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие........................ 3
Раздел I. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПРЕПАРАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ И МЕТОДЫ РАБОТЫ С НИМИ
Важность получения ферментов в чистом виде........ 5
Основные принципы работы с ферментами.......... 6
Методы очистки, хранение и определение чистоты ферментных
препаратов......................... 11
О'бщие представления................. 11
Методы очистки ферментов............... 12
Экстракция . ,.................. 13
Кислотная обработка............... 14
Термическая обработка.............. 15
Фракционирование солями ............. 15
Фракционирование органическими растворителями . . 18
Фракционирование с помощью ионов тяжелых металлов 23
Метод избирательной адсорбции.......... 23
Ионообменная хроматография........... 26
Гель-фильтрация.......».......... 36
Кристаллизация . д............... 48
Критерий чистоты препаратов ферментов ........ 49
Хранение ферментов................. 52
Исследование активности ферментных препаратов и способы
ее выражения......,................ 52
Измерение скорости ферментативной реакции...... 52
Методы определения ферментативной активности .... 54
Манометрические методы........... 54
Метод непрерывного титрования........ 55
Спектрофотометрические методы........ 55
Химические методы ... ......... 59
Выражение активности фермента........... 60
Раздел II. ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ СКОРОСТЬ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ
Концентрация фермента.........<. ,......... 63
Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной
реакции ....... ....... .......... . 63
Скорость энзиматической реакции при разных температурах 65
Оптимум рН ферментативных реакций..........•. • 67
Раздел III. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ
Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа (D-тлюкозо-б-фосфат:
НАДФ — оксидоредуктаза, 1.1.1.49) .......... 69
Выделение и очистка глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназы из
пивных дрожжей и определение ее активности .... 71
Ч4Я
Выделение и очистка глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназы из
пекарских дрожжей и определение ее активности ... 75 Свойства глкжозо-б-фосфат—^дегидрогеназы, выделенной из
дрожжей.................. 78
Фосфоглюконатдегидрогеназа (декарбоксилирующая), [6-фос-фоглюконат: НАДФ — оксидоредуктаза (декарбоксилирующая), 1.1.1.44]..................... 79
Выделение и очистка фосфоглюконатдегидрогеназы из пивных дрожжей и определение ее активности...... 80
Свойства фосфоглюконатдегидрогеназы, выделенной из пивных дрожжей................... 83
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (D-глицеральдегид-З-фос-фат: НАД — оксидоредуктаза (фосфорилирующая),
1.2.1.12).....,......................... 84
Фосфоглюконатдегидрогеназа (декарбоксилирующая), [6-фос-фатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика и определение ее активности................ 87
Свойства глицеральдегадфосфатдегидрогеназы, выделенной из скелетных мышц кролика........... 92
Выделение, очистка и кристаллизация глицеральдегидфос-фатдегидрогеназы из пекарских дрожжей и определение
ее активности.................... 95
Свойства глицеральдегидфосфатдегидрогеназы пекарских
дрожжей...................... 98
Глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (L-глицерол-З-фосфат:
НАД — оксидоредуктаза, 1.1.1.8).............. . 99
Выделение, очистка и кристаллизация глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы из скелетных мышц кролика и определение ее активности.................. 100
Свойства глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы, выделенной из
скелетных мышц кролика.............. 106
Лактатдегидрогеназа (L-лактат: НАД — оксидоредуктаза,
1.1.1.27)............................. 107
Выделение, очистка и кристаллизация лактатдегидрогена-зы из скелетных мышц кролика и определение ее активности........................ 108
Свойства лактатдегидрогеназы, выделенной из скелетных
мышц кролика................... 112
Выделение, очистка и кристаллизация лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы быка и определение ее активности . , ,..................... 113
Свойства лактатдегидрогеназы, выделенной из сердечной
мышцы.......................... 118
Алкотольдегидрогеназа (алкоголь: НАД — оксидоредуктаза,
1.1.1.1).............................. . 120
Выделение, очистка и 'кристаллизация алкотольдегидроге-
назы из печени лошади и определение ее активности . 121 Свойства алкогольдегидрогеназы, выделенной из печени
лошади....................... 125
Выделение, очистка и кристаллизация алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей и определение ее активности ......................... 127
Свойства алкогольдегидрогеназы, выделенной из пекарских дрожжей.................... 130
Стр.
Получение аммонийно-сульфатной фракции 52—64% насыщения из скелетных мышц кролика . . . ...,.,. . . . . . . 132
Получение аммонийно-сульфатной фракции 50—72% насыщения из скелетных мышц кролика . . . .,. •. . . . .;. . 133
Фосфоглюкомутаза (о-В-глюкозо-1,6-дифосфат: a-D-Глкжрзо-!-
фосфат—фосфотрансфераза, 2.7.5.1).......... 135
Выделение, очистка и кристаллизация фосфаглкжомутазы из скелетных мышц кролика и определение ее активности ......................... 138
Свойства фосфоглюкомутазы, выделенной из скелетных
мышц кролика................... 144
Гексокиназа (АТФ: D-гексозо-б-фосфотрансфераза, 2.7.1.1) . . 146 Выделение, очистка и кристаллизация гексокиназы из пекарских дрожжей и определение ее активности .... 147 Свойства гексокиназы, выделенной из пекарских дрожжей 155 Фосфофруктокиназа (АТФ: D-фруктозо-б-фосфат—1-фосфо-
трансфераза, 2.7.1.11) ................. 157
Выделение и очистка фосфофруктокиназы из скелетных
мышц кролика и определение ее активности...... 158
Свойства фосфофруктокиназы, выделенной из скелетных
мышц кролика................... 165
Гранскетолаза (В-седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-З-
фосфат — гликоль-альдегидтрансфераза, 2.2.1.1) ..... 166 Выделение, очистка и кристаллизация транскетолазы из
пекарских дрожжей и определение ее активности . . . 168 Свойства транскетолазы, выделенной из пекарских дрожжей ........................ 177
Выделение и очистка транскетолазы из печени свиньи и
определение ее активности .............. 179
Свойства транскетолазы, выделенной из печени свиньи . . 186 Рибонуклеаза (рибонуклеинат — шгримидиннуклеотидо-2-транс-
фераза (циклизующая), 2.7.7.16) ......... 186
Выделение, очистка и кристаллизация рибонуклеазы из •поджелудочной железы быка и определение ее активности......................... 188
Свойства рибонуклеазы, выделенной из поджелудочной
железы быка.................... 196
Пируваткиназа (АТФ: пируват—фосфотрансфераза, 2.7.1.40) 197 Выделение, очистка и кристаллизация пируваткиназы из
мышц кролика и определение ее активности...... 198
Свойства пируваткиназы, выделенной из скелетных мышц
кролика , ..................... . . 204
Уреаза (карбамид — амидо пидролаза, 3.5.1.5)......206
Выделение и кристаллизация уреазы и определение ее активности...................... 207
Свойства уреазы.................... 209
Фруктозодифосфатальдолаза (фруктозо-1,6-дифосфат — D-гли-
церальдегид-3-фосфат-лиаза, 4.1.2.13) . ........ . . . 210
Выделение, очистка и кристаллизация фруктозодифосфат-альдолазы из скелетных мышц кролика и определение ее активности
Свойства фруктозодифосфатальдолазы, выделенной
211
из
скелетных мышц кролика .............. 216
Фумарат-гидратаза (L-малат—гидро-лиаза, 4.2.1.2) ..... 218
Выделение, очистка и кристаллизация фумарат-гидратазы из сердца свиньи и определение ее активности..... 219
Свойства фумарат-гидратазы, выделенной из сердца свиньи 225 Глюкоэофосфатизомераза (D-глюкозо-б-фосфат—кетол-изоме-
раза, 5.3.1.9) ..... :..,.,................ 227
Выделение и очистка глкжозофосфатизомеразы из скелетных мышц кролика и определение ее активности . . . 229
Свойства глюкозофосфатизомеразы, выделенной из скелетных мышц кролика...............235
Раздел IV. ФЕРМЕНТЫ КАК АНАЛИТИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ
Общие представления............. i........ 237
Энзиматический метод количественного определения субстратов и никотинамищнуклеотидных коферментов......239
Энзиматический метод количественного определения пиро-
виноградной кислоты................ 240
Энзиматический метод количественного определения НАДФ 243 Количественное определение НАДФ с помощью глю-
козо-6-фосфат — дегидрогеназы........ . 243
Количественное определение НАДФ с помощью фос-
фоглюконатдегидрогеназы ........... 244
Энзиматический метод количественного определения восстановленной формы НАД.............. 245
Энзим этический метод количественного определения НАД 246 Энзиматический метод количественного определения этанола........................ 247
Энзиматический метод количественного определения глюкозы ........................ 249
Энзиматический метод количественного определения фруктозы ........................ 250
Энзиматический метод количественного определения глю-
козо-6-фосфата.................. . 252
Энзиматический метод количественного определения фрук-
тозо-6-фосфата................... 253
Энзиматический метод количественного определения 6-фос-
фоглюконовой кислоты................ 255
Энзиматический метод количественного определения фрук-
тозодифосфата . .................. 256
Энзиматический метод количественного определения гли-
церальдегид-3-фосфата............... 258
Энзиматический метод количественного определения диок-
сиацетонфосфата.................. 259
Энзиматический метод количественного определения трио-зофосфатов (глицеральдегид-3-фосфата+диоксиацетон-
фосфата) . ,.................... 260
Раздел V. СУЛЬФГИДРИЛЬНЫЕ ГРУППЫ ФЕРМЕНТОВ
Общие представления...... . ... . ...:.. . . . . 262
Методы количественного определения сульфгидрильных групп 267 Определение сульфгидрильных групп методом амперомет-
рического титрования................ 267
351
Метод определения сульфгидрильных групп по реакции с /г-хлормеркурибензоатом.................. . 286
Раздел VI. ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ
Получение 6-фосфоглюконовой кислоты........... 292
Метод получения фосфотриоз (эквимолекулярной смеси глицер-
альдегид-3-фосфата и фосфодиоксиацетона)...... 293
Методы получения глицеральдегид-3-фосфата........ 296
Получение глицеральдегид-3-фосфата из фруктозо-1,6-ди-
фосфата . „.................... 296
Получение глицеральдегид-3-фосфата из фруктозо-6-фос-
фата ,....................... 298
Ферментативный метод получения пентозофосфатной смеси . . 299 Ферментативный метод получения бариевой соли глюкозо-6-
фосфата (С6НпОэРВа • 7Н20)............. 305
Получение рибозо-5-фосфата................. 306
Раздел VII. НЕКОТОРЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Количественное определение фосфотриоз (глицеральдегид-3-фосфата и фосфодиоксиацетона) по легкогидролизуемому
фосфору......................... 308
Методы количественного определения белка......... 309
Метод определения белка <: помощью биуретова реактива 309
Микроопределение белка с биуретовым реактивом .... 310
Определение белка по методу Лоури........ 311
Спектрофотометрический метод определения белка по поглощению в ультрафиолетовой области........ 312
Колориметрический метод количественного определения аммиака с помощью реактива Несслера............. 314
Метод определения фосфокетопентоз (рибулозо-5-фосфата и
ксилулозо-5-фосфата)................... 315
Метод определения пентоз по реакции с орцином .......... 316
Метод определения седогептулозы............... 317
Метод определения неорганического, фосфора......... 319
Метод определения фруктозы и ее фосфорных производных . 320
Раздел VIII. МЕТОДЫ РАЗНЫЕ
Очистка эйконогена ........ .............. 323
Приготовление натриевой щелочи, свободной от карбоната
натрия......................... 323
Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония . . . 324
Приготовление реактива Несслера .............. 325
Приготовление геля гидроокиси алюминия............ 325
Приготовление кальций-фосфатного геля . ... . . . ... . . . 327
Обработка катионитов (типа IR-120 и Дауэкс 50) и анионитов
(типа IRA-400 и Дауэкс 1)............... 328
Удаление бария из бариевых солей фосфосахаров и других соединений ......'... i................i. . . ,. . 330
Номограмма для расчета числа оборотов по заданной величине g и величины g по заданному числу оборотов .... 333
Приготовление буферных растворов............. 344
Атлас кристаллических ферментов............. . 344
